Mesmo que a mastite por definição é inflamação na grande maioria dos casos é causada por infecções da glândula mamária.
Conheça as causas de um problema é um dos pré-requisitos essenciais para a escolha das melhores soluções para resolvê-lo.
Essa informação é ainda mais crítica em relação a doenças multifatoriais como a mastite, que pode ter inúmeras causas e, portanto, diferentes estratégias para o controle e tratamento.
Conceitualmente, o mastite é a inflamação da glândula mamária que se manifesta de forma clínica (com sintomas visuais de leite ou úbere) ou subclínica (apenas com alterações na composição do leite e CCS).
Em termos de controle da mastite, um passo fundamental é a implementação de um rotina de diagnóstico obter indicadores da situação da doença no rebanho.
Por exemplo, recomenda-se o diagnóstico de mastite clínica a cada ordenha (utilizando o teste do copo de fundo preto) e a mastite subclínica realizando um teste mensal para avaliar a CCS das vacas.
Mesmo que a mastite por definição é inflamação, na maioria das vezes é causada por infecções da glândula mamária, ou seja, pela presença de microrganismos, principalmente bactérias, que invadem o úbere pelo canal do teto.
Dessa forma, a manifestação da mastite na forma clínica ou subclínica dependerá da interação entre a resposta da vaca e a patogenicidade do microrganismo causador.
Atualmente, mais de 130 tipos diferentes de patógenos causadores de mastite o que reforça a necessidade de diagnosticar as causas da mastite antes de tomar decisões de tratamento ou controle.
Como não há relação entre o tipo de sintoma/manifestação da mastite e o tipo de microrganismo causador, só é possível identificar a causa da mastite por meio de exames diagnósticos específicos, como cultura microbiológica ou testes baseados em PCR.
Como diagnosticar as causas da mastite?
A identificação rápida e precisa das causas da mastite é um passo essencial na tomada de decisões sobre o tratamento e medidas de controle.
O diagnóstico de mastite pode ser feito em nível de rebanho (utilização de amostras de leite de tanque), vaca (amostras compostas pelos quatro quartos) e quarta mamária.
Amostras de leite em tanque representam o pool de leite de todas as vacas do rebanho e devem ser usadas apenas para o diagnóstico de mastite contagiosa.estreptococo. agalactiae, Staph. aureus, Mycoplasma), que são indicativos da presença de vacas infectadas com esses agentes.
Amostras compostas e da quarta mama devem ser coletadas assepticamente para evitar contaminação por microrganismos da pele dos tetos, o que dificulta a interpretação dos resultados.
Tradicionalmente, o diagnóstico das causas da mastite tem sido feito por meio da microbiologia convencional, na qual bactérias e outros microrganismos crescem em meios de cultura e podem ser identificados com base em características bioquímicas ou de coloração (meios cromogêneos).
Além da cultura microbiológica, a partir da década de 1980 surgiram os métodos de PCR (reação em cadeia da polimerase), que se baseiam na amplificação de uma região-alvo do código genético do patógeno, que funciona como se fosse uma assinatura específica de cada espécie de microrganismo .
Desta forma, por serem métodos diferentes e que podem ser utilizados em diferentes situações, é importante conhecer as diferenças, vantagens, limitações e interpretações de cada método para permitir a correta tomada de decisão.
O que é cultura microbiológica?
Os métodos de cultura microbiológica para o diagnóstico de patógenos causadores de mastite são baseados na inoculação de uma amostra de leite estéril (cerca de 10 microlitros) em meios de cultura específicos.
Esses meios de cultura permitem o crescimento de colônias de microrganismos, que podem então ser identificadas por meio das características morfológicas, bioquímicas e de coloração das bactérias.
Mais recentemente, a utilização de técnicas de espectrometria de massa MALDI-TOF, que identificam o perfil proteico ribossômico do patógeno, permite alta precisão e rapidez (cerca de 24 h) na obtenção de resultados de culturas microbiológicas.
Desta forma, o diagnóstico por cultura microbiológica permite identificar a presença de microrganismos vivos, o que é indicativo da causa da infecção da glândula mamária e tem sido considerado o padrão ouro para o diagnóstico de infecções intramamárias.
Um de limitações do uso da cultura microbiológica é a ocorrência de resultados negativos que pode ocorrer devido ao baixo número de bactérias no leite (< 100 ufc/ml), à presença de bactérias mortas e quando o microrganismo em questão necessita de meios de cultura e condições laboratoriais específicos, como no caso de Micoplasma.
Além disso, dependendo do laboratório e da logística de envio das amostras, os resultados só são obtidos após alguns dias (3-5d).
Ultimamente, o uso de sistemas de cultivo microbiológico na fazenda tornou-se uma alternativa para reduzir o tempo de obtenção de resultados, o que permite tomar decisões sobre tratamentos e outras medidas de controle de forma rápida (<24hs).
Quais são as técnicas de PCR para o diagnóstico de mastite?
A técnica de PCR indica se uma sequência de DNA alvo está presente na amostra de leite.
Simplificando, a reação de PCR ocorre quando condições favoráveis são oferecidas à enzima polimerase, que proporciona uma simulação do que acontece in vivo durante o processo de infecção, que nada mais é do que a multiplicação de cópias do DNA alvo do patógeno.
Em uma segunda etapa, a alta concentração de DNA alvo pode ser detectada de forma convencional (eletroforese em gel) ou em tempo real (RT-PCR) permitindo rapidamente o diagnóstico do patógeno causador da mastite.
A maioria dos painéis comerciais baseia-se no uso de multiplex PCR (um tipo de RT-PCR), em que várias sequências de DNA diferentes são amplificadas simultaneamente, o que permite saber se a infecção está sendo causada por um dos principais patógenos causadores da mastite .
Como o exemplo, Mycoplasma bovis, Staph. aureus, Strep. agalactiaeoutros Estreptococo e alguns tipos de coliformes, utilizando apenas uma única reação de PCR.
Os resultados são expressos em Ct (ciclo limite), que representa o número de ciclos de PCR necessários para atingir o limite de detecção do sinal de fluorescência do teste.
Quanto maior a quantidade de DNA bacteriano na amostra de leite, menor o Ct do teste.
Deve-se notar também que o teste de PCR indica a presença de DNA de um determinado patógeno, tanto de microrganismos vivos quanto mortos.
Semelhante à cultura microbiológica, a coleta correta das amostras é essencial para a interpretação dos resultados.
Uma das vantagens diferenciais em relação à cultura microbiológica é que o uso da PCR em amostras estéreis apresenta maior sensibilidade e especificidade para a detecção de agentes contagiosos do que a cultura microbiológica.
Como a PCR detecta apenas a presença de DNA e não necessita de microrganismos vivos, as amostras podem ter a adição de conservantes.
Um de limitações do uso da PCR para o diagnóstico de mastite é o uso de amostras de leite não estéreis (por exemplo, amostras coletadas para análise CCS), pois são amostras com alta contaminação ambiental ou contaminação por bactérias contagiosas de vacas previamente ordenhadas.
Este efeito de contaminação residual (chamado de ‘efeito de transmissão’) ocorre após a ordenha de vacas infectadas com bactérias contagiosas (estreptococo. agalactiae, Staph. aureus, Mycoplasma), que contamina as teteiras, mangueiras, coletores de amostras e medidores de leite e tem alto risco de gerar resultados falso-positivos nas próximas vacas coletadas na mesma unidade de ordenha.
Um estudo (1) indicou que o efeito da contaminação cruzada de Staph. aureus ocorre quando são usados amostras de leite não estéreis para diagnóstico por PCRo que causa perda de precisão e dificuldade na interpretação dos resultados.
Portanto, nessas amostras não estéreis, recomenda-se que o a interpretação dos resultados da PCR deve levar em consideração outras informações sobre a vaca (CCS, histórico de mastite clínica, ordem de coleta do leite durante a ordenha).
Para auxiliar na interpretação dos resultados do teste de PCR em amostras não estéreis, o estudo recomenda três categorias de resultados:
- (A) alta chance de infecção por Staph. aureus (valores Ct <32);
- (B) alta chance de negativo para Staph. aureus (Ct >37);
- (C) incerteza sobre o resultado da infecção por Staph. aureus (Ct- de 32 a 37).
Além do cuidado em relação à coleta de amostras, Testes de PCR indicam a presença ou ausência de DNA de um determinado patógenomas não indica se o patógeno está vivo ou morto, o que dificulta a utilização dos resultados para fins de tratamento.
Por exemplo, um estudo com infecção experimental com Estafilococo spp.
Indicaram que os testes de PCR podem detectar esse agente por vários dias, mesmo quando a cultura microbiológica já indicou a cura do agente.
Além disso, um uma limitação do teste de PCR é que apenas os patógenos incluídos no kit de diagnóstico são identificados, o que difere da cultura microbiológica na qual qualquer tipo de microrganismo viável pode crescer.
Por fim, uma das principais limitações do uso da PCR para diagnóstico de mastite é o maior custo em relação à cultura microbiológica.
Em relação à cultura microbiológica, a PCR tem menor tempo de análise (cerca de 4-5 horas em laboratório) e maior sensibilidade e especificidade.
O está indicado o uso de PCR para diagnóstico de mastite para fazendas com problemas Micoplasmapois esse microrganismo necessita de condições especiais de incubação e meio de cultura, além de apresentar crescimento lento, o que resulta em diagnóstico tardio por cultura microbiológica.
Diferenças entre cultura microbiológica e testes de RT-PCR
Conhecer as características da cultura microbiológica e dos testes de PCR é essencial para poder interpretar os resultados e considerar as vantagens, desvantagens e limitações de cada metodologia.
