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Introdução ao Diagnóstico para Sequenciamento de DNA
A importância do Diagnóstico no DNA Sequencing
O papel da bioinformática na análise de sequências
Vamos falar um pouco de Diagnóstico que é uma é tão importante né…
Pergunta 1: Por que o diagnóstico é importante na identificação de patógenos virais em animais?
Resposta: O diagnóstico é importante para determinar a presença de vírus em animais, permitindo o tratamento adequado e a implementação de medidas de controle para evitar a propagação de doenças.
Pergunta 2: Quais as principais técnicas utilizadas no diagnóstico viral em animais?
Resposta: As técnicas mais comuns incluem isolamento viral, prova molecular, sorologia, testes de patogenicidade, necropsia e PCR (Reação em Cadeia da Polimerase).
Pergunta 3: Qual é o fluxograma de diagnóstico para detecção de vírus em animais?
Resposta: O fluxograma envolve a coleta de materiais, isolamento viral em ovos embrionários ou cultivos celulares, prova molecular, testes de patogenicidade em animais, avaliação histopatológica e análise dos resultados para identificar o vírus presente.
Pergunta 4: Por que é importante garantir a confiabilidade dos resultados de diagnóstico viral em animais?
Resposta: A confiabilidade dos resultados é importante para garantir a precisão do diagnóstico, o que pode impactar diretamente no tratamento e no controle de doenças virais em animais, evitando complicações e surtos.
Pergunta 5: Quais as limitações das técnicas utilizadas no diagnóstico de vírus em animais?
Resposta: As técnicas de diagnóstico viral podem apresentar limitações na sensibilidade, especificidade e na obtenção de resultados confiáveis, o que pode afetar a precisão do diagnóstico e o manejo adequado das doenças.
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Vamos falar um pouco de Diagnóstico porque é tão importante, não é? Vocês passam tanto por isso de mandar material, de ter resultado, de saber o que foi o que era lá, qual é o vírus. Então é importante passar por aqui também, porque vai ser a técnica, as técnicas que vão trazer respostas para vocês, que vocês vão poder traçar as estratégias em cima das respostas que vocês vão obter. Então aqui vamos falar de Diagnóstico, claro, vamos focar em influência viária e o vírus da doença de Orquestra.
Diagnóstico e diagnóstico, né? Vale também para qualquer outro vírus. A gente pode encaixar aqui, tá bem. E lembrando então que a participação de vocês é muito legal, é o que deixa o nosso evento mais bacana. Então vamos lá, então, pode fazer pergunta aí, tá bom, então olha só.
Existe uma suspeita inicial, né? E daí ela pode não ter sintomatologia clínica ou ela pode apresentar sintomatologia clínica. Independente de qualquer um deste cenários, vocês leva, vocês vão fazer uma avaliação local, se necessário, vão fazer uma necropsia, vão fazer coleta de material, vou encaminhar esse material aí para diagnóstico e lá no laboratório você realizados os testes e depois o resultado volta para vocês. Então assim, de uma maneira geral, esse aí é um fluxograma que envolve muito do trabalho de vocês, tá lá. Laboratório. Então, a gente pode pegar o meu Pointer aqui, a gente pode chegar um diagnóstico de várias maneiras.
A gente pode, por exemplo, detectar a presença de um vírus diretamente, tá por isso que é direto, tá Então quando eu tô nesse lado aqui desse esquema, então eu vou, eu vou detectar o vírus através de um isolamento viral, posso fazer isso em ovos embrionados, por exemplo, né ou em aves, ou em animais seria, então isolamento em vivo, camundongos. Ou posso fazer em vidro, células, cultivos celulares, seriam, seria o ideal. Se a gente pudesse usar cultivo celular para todo tipo de isolamento, mas nem sempre dá. Então assim, o isolamento viral em vivo é uma ferramenta ainda muito, muito útil e muito importante, tá.
Também tem outras provas, né? Por exemplo, a hemaglutinação, tem provas moleculares que vão dizer, vou detectar um Genoma viral. Então eu vou diretamente saber se eu tenho ou não tenho aquele vírus ali agora nas provas moleculares, Elas têm uma limitação importante, elas não vão me dizer se ele está ativo ou não, a menos que eu faça provas, por exemplo, que detecte o RNA mensageiro, né, mas muitas provas moleculares que eu fizer apenas eu detecto a daquele material genético. Então não sei se está viável ou não, embora pode haver algum ensaio molecular, que me diga isso, então se eu quero saber se o vírus, Ele está viável está vivo ativo, perdão eu tenho que partir para alguma outra, uma outra técnica, bom do outro lado do nosso esquema, eu tenho uma maneiras indiretas de saber se aquele vírus passou por ali, né? Seria, por exemplo, aí a sorologia, né? Então eu vou avaliar o soro de animais, que eu acredito que estejam infectados, o que for infectados por aquele vírus e aí vou fazer Elisa, vou fazer a inibição da hemaglutinação, eu vou fazer a GP, né, então assim tem maneiras de eu detectar o vírus.
O vírus, além disso. Existem os testes de patogenicidade, que é onde eu vou então pegar aquele vírus, aquele material que eu suspeito que tem o vírus ali dentro e vou usar para infectar animais, para eu conseguir reproduzir a doença, tá bem a necropsia, então a necropsia ela é, importante, claro, né, ali nós vamos poder coletar material para levar para diagnóstico e também nós vamos poder fazer uma série de avaliações a respeito das lesões que nós estamos vendo ali, tá. Então no caso da influência do vírus de newcast, Então, nós vamos coletar. Nós, Suave de traqueia, ou de, orofaringe, também podemos coletar suave de cloaca para confirmar esses diagnósticos, então, né, a gente a sorologia, ela vai indicar que houve uma infecção pelo vírus, mas não vai determinar quando e também se ainda ouvir os está lá, tá. Então é importante que e por isso que exigem as, normas existem, existem né, que para onde diagnóstico definitivo além da coleta do soro, tem que ser realizada também coleta de material para isolamento viral e diagnóstico molecular, O isolamento viral, ele é, difícil, ele nem sempre a gente consegue, por que as muitas vezes já, já não tem mais uma quantidade de vírus, ali ou vírus não está numa condição ideal para a gente poder isolar ele e mais um diagnóstico molecular daí ele vem bem a clarear porque ele normalmente ele, ele consegue, né, pela precisão que ele tem pela sensibilidade que ele tem ele consegue nos trazer maior resultados bem robustos, tá, então lá para o.
Isolamento viral então né, É coletado o material, seja Suave ou seja, um órgão esse material, se for ele, é processado, né, Se for um órgão, por exemplo, ele aqui, a gente tá vendo o órgão foi macerado esse macerado ele vai ser centrifugado, para a gente dar uma, limpada, nele, né, para poder baixar todo o material ali, Que tá em excesso e Como os vírus, Eles são, muito pequenos, eles normalmente vão ficar em suspensão e dá, Então, essa peça suspensão, ela é tratada, é adicionada com antibióticos e daí no caso da influência vai para o isolamento virar em ovos em ovos.
Embrionados, influência é o vírus da bronquite, uma série de vírus, a gente faz esse processo aqui, bom, esse processo aqui, como vocês podem ver aqui né, Então olha lá, faz uma infecção, espera ali quatro a sete dias, se dá nega, faz mais uma passagem, se dá, Negativo, faz mais uma passagem, E aí se vão, né, gente duas, três semanas se dá positivo. Opa, interrompe ali o, processo, né, já deu positivo e aí se caracteriza o vírus, se verifica se é Newcastle ou qual tipo de influência, né, separa entre os subtipos de influenza e por fim faz o.
Teste de patogenicidade nas aves, aí a gente tem uma caracterização bem bacana, mas vejam, né, olha o tempo, e olha o custo que tem isso aqui, né, imagina cada ovo, embrionário, ovos SPF, né, ainda que são livres de vários tipos de patógenos Então são ovos muito, muito caros e a gente precisa de vários, probabilidades de cinco a nove ovos cada vez que tu vai trabalhar com cada amostra dessas, aí que tu tá, tentando isolar então é, um processo lento, um processo caro um, processo que muitas vezes a gente não consegue, porque ele é, muito bom né, é, muito frequente O vírus de ave ele não, não, tá adaptado ao cultivo celular e a gente não conseguia adaptar ele, mas usando o, o ovo, embrionário, Nossa, o vírus vem super bem, esse, multiplica super bem e muitas vezes ele causa efeitos que mostram para a gente que é o vírus, Instalado qual tipo de vírus que é, então nos dão ótimos indicativos da presença do vírus ali, tá, aqui vocês estão vendo umas, imagens de, né, do isolamento viral que é feito, que lembrar né marcando os ovos depois do, vosso código fazendo um furinho na casca do ovo ali depois fazendo as infecções colocando, Na estufa, né, para manter o ovo viável durante o processo de inoculação, tá bem, é bom, deu positivo, né, então lá, subtipo, de hemodinina, Então a gente tem que verificar qual é o tipo de H A se for aquele vírus de influência, né E se for influência, Tem que ver também, Qual é o tipo de neutralidade, no caso do necastle então também tem que fazer uma, tipificação, e avaliar, né, para tentar caracterizar o melhor possível, aquele vírus ali, os, teste de patogenicidade Vivo que eu falei lembra eles então são feitos em aves isso feito dentro de isoladores que nem, Isso aqui que a gente tá vendo na imagem, este aqui inclusive, ele é um dos nossos aqui da Embrapa então quando necessário fazer, Os experimentos a gente coloca as aves aqui dentro, né, Eles deixa elas ali se ambientando durante um tempo e daí depois faz o, experimento faz as, Inoculações daí depois coleta material coleta sangue ou coleta Suave ou depois tira os animais daqui para fazer aí, eutanásia e a necropsia e coleta material, tá, bem, esses, isolador então ele tem pressão positiva e ele tem filtro, Epa, então assim é um local, seguro para a gente poder trabalhar, com vírus, que a.
Gente não quer que eles se espalhem por aí né por alguma questão de, biossegurança Então são, avaliados, né, com, os testes de patogenicidade, são avaliados os índices de patogenicidade, intra-cerebral, né, por vírus da doença de Newcastle e o índice de patogenicidade, e Vivo, para influência são informações importantes para fechar o, diagnóstico.
Uma outra maneira então, seria usar o Agepê, né, hgel precipitação, então aqui podemos diferenciar Newcastle, influência, a gente coloca então por exemplo um soro positivo ou um soluto aqui nos, orifícios, né, no meio aqui e botamos o soro que a gente tá tentando testar e os antígenos a gente coloca na, volta ou soros teste por exemplo E aí quando houver o reconhecimento de anti corpo para antígeno, Vai haver a formação dessa linha de precipitação que vocês estão vendo aqui então aqui, eu tenho aqui por exemplo um soro positivo, que tá reagindo com o meu controle, Positivo, tá reagindo também com essa com essa, suspensão aqui aonde vocês viram que tem essa linha de precipitação aí é positivo, aonde não tem é porque é, negativo Então essa técnica é uma técnica, simples de fazer, mas ela tem uma uma baixa sensibilidade então não é sempre que a gente consegue uma responder, de forma eficiente, uma pergunta fazendo essa técnica aqui tá mas ela é muito, muito fácil de fazer e ela é, rotineiramente utilizada, aí, tá, a inibição da emaglutinação, ela pode ser feita então direta ou indireta então direto é quando eu.
Percebo eu coloco as hemácias coloco vírus e percebo que que o vírus emaglutinou as hemácias ou não né Se ficar aquele as placas Elas têm um fundo cônico então se a hemácia não for aglutinada ela vai se depositar no fundo da placa vai ficar um, botãozinho, assim se o vírus, Está presente e emaglutinar a hemácia ela vai ficar dispersa vai ficar não vai ficar um botãozinho assim ela vai ficar disperso em todo o líquido dali ou, talvez eu não consiga fazer essa prova de uma forma direta só com a hemácia, e com o vírus eu vou ter que usar um, anticorpo, então eu pego e avalio ou vou usar para avaliar a presença ou não do anticorpo e vou usar então anticorpo e a hemácia e vou ter mais ou menos aí um resultado semelhante a esse resultado que a gente viu com relação a emaglutinação que a gente estava vendo então, né e a, Inibição de magnetização, Então olha aqui, né, olha só então aqui é quando, na placa, né, ele vai ficar com esse formato aqui tá, então aqui provavelmente é uma prova, indireta, então aqui para ele, tá contando como positivo quando.
Quando não é uma, glutinação e aqui negativo quando tem A hemaglutinação tá, mas porque aqui é um, teste indireto, Mas eu só queria mostrar para vocês como que fica a placa aqui independente de o teste é, direto ou indireto quando dependendo do que que tu tá procurando tu vai ficar com este tipo de, layout na placa, aqui tá bem então por exemplo lá para influenza é, Tu vai lá fazer a tipificação e coloca o soro e coloca o né ou vai colocar o E aí vai fazer a prova e daí tu vai ver vai ver aonde é uma botina onde não é uma botina E aí tu vai podendo caracterizar o vírus da, Influênza ou o vírus dados ou algum outro vírus né, que que acabe podendo ser utilizado numa prova dessas aqui de, hemaglutinação ou de inibição de emaglutinação já no, Elisa, bom, Elisa então é uma prova, extremamente maleável a gente pode montar uma Elisa para detectar anticorpos a gente pode montar, uma Elisa para, detectar o antígeno esse Lisa ele pode ser direto, indireto de competição nossa tem uma série de alternativas uma técnica muito, bacana, normalmente então nós temos uma, placa.
E aí nós vamos, dependendo da de como o teste foi montado nós temos, na placa, antígeno ou, posso ter, anticorpo aí eu vou colocando, Então o meu soro teste ou a suspensão que eu tô testando depois eu coloco uma série de, anticorpos no final o que importa é que eu tenha reações que, Podem ser medidas reações de cor que, Podem ser medidas entre um positivo ficar colorido por exemplo e um, negativo não ficar colorido ou o contrário, um positivo ficar não colorido, e O negativo ficar colorido Porque daí vai, depender como que eu não tenho teste essa placa, depois das incubações eu levo ela num.
Leitor, um leitor, óptico que vocês estão vendo aqui, esse leitor então ele vai avaliar a cor de cada um dos postos e vai transformar, Isso numa leitura numa densidade, Ótica E aí eu vou fazer um cálculo que vai me dizer, Se quanto maior a, densidade, Ótica, Mais, Positivo quanto, Menor a, densidade óptica mais, Negativo, por exemplo, né, E aí eu vou interpretar, O teste aqui, olha que bonito que fica, né, ó, Então sei lá o azul aqui ele, tava indicando alguma coisa, né, é normalmente é, positivo ou, negativo, tá, então assim sei o azul tá me, indicando que ele é, Negativo e o, amarelo queria, positivo, por exemplo, Sei lá o contrário, Mas o importante é que fique uma diferença fácil da gente poder avaliar, tá, E que a máquina o leitor consiga traduzir essa informação aqui da cor numa,
Este texto não reflete, necessariamente, a opinião do Jornal Do Campo
# FAQ sobre Diagnóstico e Sequenciamento em Virologia
## Diagnóstico – Perguntas Frequentes
### Como funcionam as técnicas de Diagnóstico?
– Que técnicas são utilizadas para detectar a presença de vírus?
– O que é o isolamento viral e como é feito?
– Quais são as vantagens e limitações das provas moleculares para diagnóstico?
### Qual é a importância do diagnóstico na Virologia?
– Por que é essencial diagnosticar a presença de vírus em materiais coletados?
– Como o diagnóstico contribui para traçar estratégias de prevenção e controle de doenças virais?
### Quais são os métodos utilizados para coleta de material para diagnóstico?
– Quais são os cuidados essenciais para coletar e transportar o material para diagnóstico?
– Por que a coleta de material é crucial para um diagnóstico preciso?
## Sequenciamento – Perguntas Frequentes
### Como funcionam os sequenciadores de DNA?
– Qual é o processo de sequenciamento de DNA em capilares?
– Quais são as alternativas ao sequenciador de capilares, como o sequenciamento de nova geração?
### O que é bioinformática e qual é seu papel no sequenciamento de DNA?
– Como os bioinformáticos lidam com a quantidade massiva de resultados gerados pelo sequenciamento de nova geração?
– Por que a análise bioinformática é essencial para gerar sequências completas a partir dos fragmentos de DNA sequenciados?
## Conclusão
Esperamos ter respondido suas dúvidas sobre o diagnóstico e sequenciamento em Virologia. Se você tiver mais perguntas ou quiser saber mais sobre esse tema, não hesite em nos contatar. Sua participação é fundamental para enriquecer nosso conhecimento e aprimorar as estratégias de diagnóstico em Virologia. Obrigado pela leitura!
